激光共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM）是一種高性能的光學(xué)顯微成像技術(shù)，以下是對其功能和應(yīng)用的詳細介紹：

功能

高分辨率成像：

激光共聚焦顯微鏡通過使用激光作為光源，結(jié)合共軛空間針孔濾波器，排除了非焦點平面的散射光，從而大幅提升了圖像的分辨率和對比度。

能夠進行高分辨率的二維和三維成像，適用于觀察細胞結(jié)構(gòu)、分子定位以及實時動態(tài)過程等。

光學(xué)切片：

利用照明點與探測點共軛特性，可有效抑制同一焦點平面上非測量點的雜散熒光及來自樣品中非焦平面的熒光，從而獲得普通光鏡無法達到的分辨率。

具有深度識別率和縱向分辨率，可以逐層獲得高反差、高分辨率、高靈敏度的二維光學(xué)橫斷面圖像，對活的或固定的細胞及組織進行無損傷的系列“光學(xué)切片”，得到各個層面的信息。

三維圖像重建：

通過薄層光學(xué)切片功能，可獲得真正意義上的三維數(shù)據(jù)。

經(jīng)過計算機圖像處理及三維重建軟件，沿X、Y和Z軸或其它任意角度來觀察標(biāo)本的外形及剖面，并得到三維的立體結(jié)構(gòu)，從而能十分靈活、直觀地進行形態(tài)觀察，并揭示亞細胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。

熒光定量與定位分析：

可對單標(biāo)記或雙標(biāo)記細胞及組織標(biāo)本的共聚焦熒光進行定量分析，并顯示熒光沿Z軸的強度變化。

可自動將熒光圖像與相差圖像重疊以顯示熒光在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的精確定位，還可測量標(biāo)本深層的熒光分布。

細胞物理化學(xué)測定：

可進行低光探測、活細胞定量分析和重復(fù)J佳的熒光定量分析。

能對單細胞或細胞群的溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞骨架、結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞特異結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進行定性、定量、定時及定位測定。

離子實時定量測定：

是測量若干種離子濃度并顯示其分布的有效工具，對焦點信息的有效辨別使在亞細胞水平顯示離子分布成為可能。

利用熒光探針，可以測量單個細胞內(nèi)pH和多種離子（如Ca2?、K?、Na?、Mg2?）在活細胞內(nèi)的濃度及變化。

應(yīng)用

生物學(xué)與醫(yī)學(xué)研究：

在形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域，激光共聚焦顯微鏡提供了觀察活細胞結(jié)構(gòu)及特定分子、離子生物學(xué)變化的強大工具。

可用于細胞形態(tài)定位、立體結(jié)構(gòu)重組、動態(tài)變化過程等研究，并提供定量熒光測定、定量圖像分析等實用研究手段。

腫瘤與抗癌藥物篩選：

可對單標(biāo)記或者多標(biāo)記細胞、組織標(biāo)本及活細胞進行重復(fù)性J佳的熒光定量分析，從而對腫瘤細胞的抗原表達、細胞結(jié)構(gòu)特征，以及抗腫瘤藥物的作用及機制等方面定量化。

血液病學(xué)與醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：

觀察免疫細胞和系統(tǒng)，如樹突狀細胞、單核-吞噬細胞系統(tǒng)、自然殺傷細胞、淋巴細胞等，在準(zhǔn)確細胞定位的同時有效鑒定免疫細胞的性質(zhì)。

眼科研究：

觀察晶狀體、角膜、視網(wǎng)膜、虹膜和睫狀體的結(jié)構(gòu)和病理變化。

骨科研究：

在觀測骨細胞形態(tài)學(xué)研究、骨細胞特異性蛋白（如骨鈣素）以及骨細胞之間的相互作用方面具有顯著優(yōu)勢。

此外，激光共聚焦顯微鏡還可用于植物細胞研究、細胞間通訊研究、細胞膜流動性測定以及光活化技術(shù)等多個領(lǐng)域。

分類

激光共聚焦顯微鏡根據(jù)其原理和應(yīng)用特點，可以分為以下幾種類型：

點掃描共聚焦顯微鏡：

使用激光作為光源，通過一個微小的光束掃描樣品。

樣品中的熒光分子在激光激發(fā)下發(fā)光，這些熒光信號通過一個針孔被檢測，只有來自焦平面的熒光信號能夠通過針孔到達探測器。

能夠提供高質(zhì)量的三維圖像，適用于固定細胞和組織的詳細結(jié)構(gòu)分析。但成像速度相對較慢，光毒性較強，可能不適合長期或高速的活細胞成像及大組織樣本的數(shù)據(jù)采集。

轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡：

使用一個帶有微透鏡陣列的轉(zhuǎn)盤來增加照明效率和采樣速率。

多個針孔同時工作，與點掃描相比，可以提供更快的成像速度和較低的光毒性，適合活細胞成像和長時間觀察，快速獲得共聚焦分辨率的切片掃描數(shù)據(jù)。

還能提供較好的視野和較高的靈敏度，適用于弱信號的檢測。但分辨率略遜于點掃描共聚焦顯微鏡。

超分辨共聚焦顯微鏡：

能夠突破傳統(tǒng)光學(xué)衍射J限的顯微鏡技術(shù)。

通過多種技術(shù)手段（如STED、PALM、STORM等）實現(xiàn)納米級別的分辨率。

可以提供Q所未有的高分辨率圖像，適用于觀察細胞內(nèi)J為精細的結(jié)構(gòu)（如細胞骨架、病毒粒子和蛋白質(zhì)復(fù)合物等）。但成像速度較慢，操作較復(fù)雜，且設(shè)備成本較高。

綜上所述，激光共聚焦顯微鏡具有多種功能和廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究以及材料科學(xué)等領(lǐng)域中不可或缺的重要工具。